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ELISA样本制备指南及注意事项

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定义及介绍

ELISA（enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定）是最基础的免疫学实验之一，其理论基础是抗原抗体的特异性反应。ELISA因其特异性强、灵敏度高、稳定性好而被广泛使用。ELISA试剂盒检测样品包括血清、血浆、细胞培养上清、灌洗液或尿液等生物样本，实验操作步骤并不繁琐，但实验完成后需要把样本检测结果OD值转化为浓度值，从而供下一步分析所用，因此样品的预处理对于后续数据处理和结果分析非常重要。

样本制备指南

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血清

全血样品于室温放置2小时或2-8℃过夜后于2-8℃，1000×g离心20min，取上清即可检测。收集血液的试管应为一次性的无内毒素试管。避免使用溶血，高血脂样品

2.血浆

抗凝剂推荐使用EDTA-Na

，样品采集后30min内于2-8℃，1000×g离心15min，取上清即可检测。

3组织匀浆/组织全蛋白

用预冷的PBS (0.01M, pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液，称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS(一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行反复冻融或超声破碎。最后将匀浆液于2-8℃，5000×g离心5-10min，取上清检测。

其余方法：在分析天平（AL204型）上，称量50-100mg组织样本。在样本中加入5倍质量体积的含1%PMSF的1×PBS缓冲液；并用小剪刀等工具将组织样本剪碎（尽可能小块）。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开超声破碎仪，将超声破碎仪的功率调至25%，超声时间2s，间隔时间5s，总时间2min。放入样本，冰上超声3min。视样本匀浆情况调整总时长。超声完成后，将样本放于4℃或冰上裂解30min。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。

组织匀浆液或组织全蛋白中的蛋白浓度对于检测实验的影响至关重要，建议样本蛋白浓度至少1mg/mL以上，较低浓度蛋白的组织匀浆液有可能导致ELISA检测失败。

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4.细胞提取液

贴壁细胞

用冷的PBS轻轻清洗，然后用胰蛋白酶消化，1000×g离心5min后收集细胞；

可直接离心收集。收集的细胞用冷的PBS洗涤3次。每10

个细胞中加入150-200μLPBS重悬(推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂；若含量很低可减少PBS的体积)并通过反复冻融或超声使细胞破碎。将提取液于2-8℃，1500×g离心10min，取上清检测。注：留取20μL样本，用于后续BCA测定。

其余方法：

对于

：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。以2百万细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。

对于

：离心收集细胞，以2×10

细胞为例，在样本中加入100μL的含1%PMSF的1×PBS缓冲液，震荡混匀细胞，4℃或冰上裂解30min。用手指轻弹悬浮细胞以充分裂解。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成（5-10）×10

细胞/管，然后再裂解。必要时可以进行超声处理，超声步骤与组织样本相同。注：1×PBS缓冲液使用前，需加入PMSF，现用现加，PMSF终浓度为1mM。打开离心机，将转速调至12000×g；将样本放入离心机，离心10min，取上清，按需要分装，于-20℃贮存。注：留取20μL样本，用于后续BCA法测定样本蛋白含量。

5.细胞培养上清或其他生物体液

收集液体后于2-8℃，1000×g离心20min，除去杂质及细胞碎片。取上清检测。注：因细胞培养基中的胎牛血清影响或其他生物体液中杂蛋白的影响，不建议进行BCA法测定样本蛋白含量。

实验细节与注意事项

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收集血液应避免产生溶血现象。红细胞破碎，释放大量的过氧化物酶，会影响ELISA检测中的辣根过氧化物酶（HRP）或碱性磷酸酶（AP）的酶促反应，造成检测结果的不确定性。

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样品收集后若在1周内进行检测可保存于2-8℃，若不能及时检测，请按一次使用量分装，冻存于-20℃(1个月内检测)，或-80℃(3个月内检测)，避免反复冻融。在检测前，冷冻过的样本应缓慢地融化并离心除去冻融过程产生的沉淀物。室温混匀后使用。

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试剂盒检测范围不等同于样本中待测物的浓度范围，建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度并通过预实验确定样本的实际浓度情况。如果样品中待测物浓度过高或过低，请对样本做适当的稀释或浓缩。

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检测样本的稀释推荐多步稀释法，常规稀释检测为血清/血浆检测稀释度为2倍、20倍、200倍；细胞上清稀释度为5倍、50倍、500倍；建议实验前通过相关文献预估样本中待测物的浓度。

对于稀释倍数比较大的检测样本，参考稀释方案如下：

稀释100倍：一步稀释。取5μL样本到495μL标准品/样本稀释液内，做100倍稀释；

稀释1000倍：两步稀释。取5μL样本到95μL标准品/样本稀释液内，做20倍稀释，再取5μL 20倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释1000倍；

稀释100000倍：三步稀释。取5μL样本到195μL标准品/样本稀释液内，做40倍稀释，再取5μL 40倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，最后取5μL 2000倍稀释样本到245μL标准品/样本稀释液内，做50倍稀释，总共稀释100000倍；

每步稀释时取液量不少于3μL，稀释倍数不超过100倍。每步稀释都需混合均匀，避免起泡。

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若所检样本不在说明书所列样本之中，建议做预实验验证其检测有效性。

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若使用化学裂解液制备组织匀浆或细胞提取液，由于引入某些化学物质会导致ELISA测值出现偏差。

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某些重组蛋白可能与试剂盒中捕获或检测抗体不匹配而出现不能检测的情况。

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对于组织匀浆、组织全蛋白、细胞提取液等蛋白提取样本，经BCA法测定样本蛋白含量后，建议进行蛋白浓度的统一化，避免因组织重量、细胞数、产物体积等因素造成的人为误差；例如，统一全部检测样本浓度为1-2mg/mL，进行后续的稀释和检测。

胚胎移植是试管婴儿助孕技术当中的非常重要的一步，也是最关键的一步骤。从移植完毕到检查到底有没有怀孕这段时间当中患者通常是最为紧张的，希望能够尽快得到好孕的消息，然而又会非常担心，会不会失败，这样的纠结情绪对于的患者的心理承受能力来说是个很大的考虑。

经常有人会产生这样的疑问，在胚胎移植后医生给我开了很多很多的药，我肯定是会遵医嘱按时去吃药的，但是，平时经常听说有些人吃了某种食物可能会产生不良反应，那么， 在胚胎移植后的这段时间，饮食方面是不是也有相应的注意事项啊，到底吃什么最适合胚胎移植后这段时间的身体需要呢，吃什么可能不利于胚胎的着床，或者不利于胚胎的发育等等问题呢，我们一起看看下面的内容吧，希望能够对您有所帮助。

　试管婴儿移植后的饮食

在胚胎移植后，因为可以正常工作和生活，但又不能做太累的运动，而患者朋友又希望能够做些什么来促进怀孕，那么，就又很多患者询问到底在胚胎移植后吃什么会更加有助于胚胎的着床呢?另外，吃什么比较有助于试管婴儿移植的成功?

首先，我们应该明确是，试管婴儿的患者应该属于“健康人”的范畴的，所以移植后吃什么、喝什么，其实没有太大的限制，首先一点就是要坚持一如既往的饮食，不要突然间因为移植的原因，而迅速的改变了自己的饮食习惯以及饮食的结构，更不需要你在这个时候突然进行大养大补。你要知道，你的那颗小小的胚胎在妈妈给的小房子当中能否猛吃猛喝，能否大补大养在怀孕初期跟妈妈外在的补养是没有太大关系的，大家都应该知道，试管婴儿在治疗过程当中用过很多药物，有些药物是有可能会造成便秘的，再加上移植后的活动不多，消耗较少，这个时候很容易引起便秘、消化不良等问题，而且大补还容易上火，对于女性来说，这段时间忌大补。

一般来说，西医一般是不太讲究忌口的。但不管是通过中医还是西医，让自己能够吃舒服，吃健康才是最为重要的。而至于试管婴儿胚胎移植后的饮食，其实并没有过多要求，不过，下面这几方面应加以注意：

一、要选择更容易消化的食物

在胚胎移植后因为休息、不自主的运动量减少、心理压力的增大，女性有可能可食欲下降，或者消化不良等问题，所以选择比较容易消化的食物是相当重要的。

　二、避免便秘

前面我们提到了试管婴儿治疗过程当中到一些用药有可能会引起便秘，比如孕酮(黄体酮)类的药物就有可能会导致肠道肌肉的松弛，造成肠蠕动的减慢，如果再加上运动量少的问题，非常容易引起便秘短发。为了缓解女性便秘的症状，一定要注意多吃一些富含高纤维的蔬菜、还有水果，尽量少食用一些辛辣的食物。

　三、避免腹泻

由于有很多患者不是生殖中心所在的本地人，在胚胎移植后的这一段时间可能有些人选择了住旅馆，吃快餐，这种情况很容易“水土不服”，或者说是肠胃不适，第一反应就是腹泻，所以，饮食当中也应注意的是饮食的卫生。

　四、禁吃造成过敏的食物

如果你本身有过敏体质或者是对某种物质过敏的话，一定要注意让自己能够远离过敏原，不要吃那些非常容易引起过敏的食物，既往如果没有吃过的东西在这个时候也尽量不要乱吃。

　五、高蛋白饮食

对于存在卵巢过度刺激的这部分女性来说会出现纳差、或者是腹胀等不适等问题，应予高蛋白易消化饮食，应该注意要少吃多餐，适量的控制盐分的摄入，另外，每日的蛋白质供应在1.5到2g/kg，总量一般是在100克到140克，其中应该优质的蛋白质为主。可以选择的比如鸡鸭鱼肉，蛋类，或者是大豆及其相关制品。热能及维生素的供应也要充足。

　六、少吃多餐

移植后的患者经常是会出现动少静多的现象，再加上进食的精细，加上应用保胎的药物等方面，心情出现焦虑，睡眠质量欠佳，多有饱胀感等问题，这些现象都在提示我们，应该注意应少食多餐。可采用两餐之间加餐的方法，以牛奶、豆浆、或者鸡蛋、蛋糕等这类的高蛋白的食物为宜。

说完适合吃什么，下面我们，一起来说说，那么在试管婴儿助孕的过程中是胚胎移植后的这段时间有哪些食物是不能吃呢?

其实一般情况下医生不会特意跟患者说有什么东西需要忌口，什么是不可以吃的。所以大部分情况下，患者也无需紧张，饮食方面其实没有什么特别的禁忌。可以适当的多吃一些高蛋白的食物，以此来确保营养均衡。

但是对于早期怀孕的孕妇来说，有些食物的确是应该慎选的，比如：

　一、桂圆、荔枝

桂圆和荔枝尽管这两种水果安神补血、养血益脾的动销，但因为其二者性温太热，如果确定怀孕，吃这些但不能达到安胎的作用，反而容易出现漏红、腹痛等一些先兆流产的症状。所以在移植之后应该忌食。

　二、杏仁

杏仁当中含有氢氰酸有毒物质，孕妇不要使用，食后这种物质会通过胎盘进入到胎儿体内，影响胎儿的正常发育。

三、山楂

具有活血通淤、以及收缩子宫的功效，所以，如果移植后确认怀孕了不要吃山楂，因为山楂可能会引起流产、早产。

　四、黑木耳、木耳菜

尽管，对于普通人来说，这两种食材有滋养易胃、活血化淤的作用，但是，如果对于移植后怀孕的，孕妇食后是不利于胚胎的生长和安全，具有抗孕、可能引起流产以及早产的可能。

五、马齿苋

由于其性寒冷而滑利，所以，有可能会对子宫带来显著的兴奋作用，因此，孕妇在食后很容易导致流产。

六、久存的土豆

这种土豆生物碱的含量非常大大，在食后很有可影响到胎儿的正常发育，从而造成胎儿生长过于缓慢。

七、热性的香料

像一些小茴、大茴、花椒、胡椒、五香粉等这些都是热性的香料，食后非常容易消耗肠内的水份，引起便秘，导致腹压增加，有可能会压迫到子宫当中的胎儿，很容易造成自然流产、或者早产羊水早破等问题，普通人也要注意少吃，对于移植后怀孕的宝妈来说更要谨慎。